Народився 7 листопада 1855 року в селі Сонцівці Харківського повіту (нині село Борисівка Дергачівського району Харківської області) в родині сільського псаломщика і селянки. З 1867 року навчався у Харківському повітовому училищі. 1874 року вступив до Харківської духовної семінарії, але не закінчив її і 1877 року вступив до Харківського університету на історико-філологічний факультет. 
По закінченні університету 1881 року був залишений як обдарований студент позаштатним стипендіатом для підготовки до професорського звання. З 1897 року, відмовившись від офіційно запропонованої на факультеті теми з загальної історії, починає студіювати історію Запорожжя. У 1881—1882 роках вийшла перша його праця — «Виникнення і будова Запорозького Коша», за що його було позбавлено університетської стипендії. Здійснює експедиції по місцях Запорозької Січі. З весни 1884 року читає серію публічних лекцій під назвою «Про запорозьких козаків».
1884 року університетське начальство за сепаратизм та відверте українофільство звільняє Яворницького з посади в університеті. 1885 року він переїжджає до Петербурга, де знайомиться з І. Рєпіним, пише низку статей з історії Запорожжя, передмову до поеми «Гайдамаки».
Того ж року Яворницький стає членом Археологічного товариства, викладає історію в кількох навчальних закладах. За порадою Яворницького Ілля Рєпін починає працювати над картиною «Запорожці пишуть листа турецькому султанові», користуючись матеріалами та колекцією вченого.
Дмитро Іванович надихнув Миколу Лисенка на створення опери «Тарас Бульба». 16 червня за політичну неблагонадійність Яворницького знову позбавлено права викладати і звільнено з роботи. 1888 року опубліковано двотомник «Запорожжя у залишках старовини і переказах народу» та «Збірник матеріалів для історії запорозьких козаків».
1891 року Яворницький повертається до Харкова в пошуках роботи, але, не знайшовши її, знову їде в Петербург. Навесні 1892 року виходить перший том «Історії запорозьких козаків», а невдовзі Яворницького посилають у трирічне відрядження, а фактично висилають у Середню Азію, де він працює молодшим чиновником особливих доручень при туркестанському генерал-губернаторі в Самарканді.
1895 року, відбувши заслання, вчений від’їжджає до Варшави, планує скласти у Варшавському університеті магістерський іспит. З 1897 року власті дозволили Яворницькому жити в Москві, де він стає приват-доцентом Московського університету.
1902 року захистив у Казанському університеті магістерську дисертацію. Того ж року переїхав до Катеринослава, став директором Музею старожитностей Катеринославської губернії. З 1920 по 1933 рік працював в Інституті народної освіти у Катеринославі, у 1925—1929 році завідував кафедрою українознавства, був професором. З 1927 року — відповідальний керівник експедиції з виявлення старожитностей під час будівництва Дніпрогесу. До останніх днів життя завідував Дніпропетровським історичним музеєм, брав участь у численних експедиціях по місцях Запорозької Січі. Крім фундаментальної «Історії Запорозьких козаків» у трьох томах (1892—1897), написав ще понад двісті праць, присвячених здебільшого українській історії. Виступав також як поет і прозаїк, уклав «Словник української мови» (1920). З 1929 року — дійсний член Академії наук УРСР.
Помер Дмитро Іванович Яворницький 5 серпня 1940 року. Поховано видатного вченого у Дніпропетровську, на території створеного ним музею, що носить його ім’я.

   Дмитро Іванович Яворницький був людиною надзвичайно різнобічних інтересів, ініціативним і невтомним трудівником на ниві національної культури. З його іменем насамперед пов’язана подвижницька праця із збирання, дослідження й популяризації історії запорозького козацтва. Він залишив помітний слід як археолог, етнограф, фольклорист, лексикограф, автор великої кількості наукових статей, публікацій у періодичних виданнях. Праця над темами з історії українського козацтва в умовах дії в Росії Емського та Валуєвського указів про заборону української культури була виявом його патріотизму та громадянської мужності.
Яворницький був одним з перших некабінетних вчених. За життя йому довелося брати участь у розкопках сотень курганів, козацьких могил. 
Вагомий внесок зробив Яворницький у становлення історичного краєзнавства. Крім історії Запорожжя, яка й досі не втратила свого значення, він написав історію міста Катеринослава, села Фаліївки-Садової на Херсонщині, видав альбоми «української старовини» та «Дніпрові пороги», науково-популярне видання «Слідами запорожців», безліч розвідок та популяризаторських статей, якими започаткував жанр так званої краєзнавчої, або, як нині її називають туристської літератури..
   Завдяки його невтомній праці вони побачили світ і дали можливість сучасникам поновому оцінити Запоріжжя як світове явище, як лицарську організацію з демократичним парламентським устроєм. 
 Окремою яскравою сторінкою творчої біографії Яворницького є його етнографічна та фольклористична діяльність. Збірник зібраних і записаних ним в експедиціях протягом 1878—1905 років взірців народного мелосу — «Малоросійські народні пісні» (1906) сучасники називали кращим серед подібних праць у тогочасній Росії.
   Всебічно вивчаючи життя й побут українського народу, Яворницький виявляв великий інтерес до народного мистецтва, зокрема до народної вишивки та писанкарства. 
Яворницькому належить першість відкриття й дослідження петриківського декоративного розпису, нині відомого в усьому світі. 
Ще однією важливою рисою Яворницького як збирача народної творчості є те, що він надавав великого значення виявленню і популяризації талановитих народних співців-кобзарів та розповідачів. Дмитро Іванович відіграв велику роль у житті й творчості багатьох кобзарів, зокрема Пасюги, Кучугури-Кучеренка, Кожушка та ін. Завдяки енергії й завзяттю немолодий вже Яворницький до початку будівництва Дніпрогесу та під час його організовував обстеження будівельних робіт і виявив багато цінних знахідок, які могли бути назавжди втрачені.  
До останніх днів вчений дотримувався свого життєвого кредо: «Працюй, працюй, не вдивляючись уперед і не озираючись назад; працюй, не чекаючи нізвідки і ні від кого ні нагороди, ні подяки; працюй, поки служать тобі руки і поки б’ється живе серце у твоїх грудях; працюй на користь свого народу і на користь своєї Батьківщини…»